WIPO专利WO1992018120A1 Preventive or remedy for ischemia, reperfusion-induced tissue disorder and arrhythmia as well as pul

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公开号:WO1992018120A1
申请号:PCT/JP1992/000475
申请日:1992-04-15
公开日:1992-10-29
发明作者:Takayuki Ozawa；Satoru Sugiyama
申请人:Teijin Limited；
IPC主号:A61K31-00

专利说明:
[0001] 處血 ·再囊観鐘纖錄害 Jtび不整戮盖び ICS性酸素 · フ 9一ラジカルよる讓錄辔€予鎵又は療 m 虚血 · 再灌流組織障害及び不整脈並びに活性酵素 · フリーラジカルによる肺障害の予防又は治療剤技術の分野
[0002] 本発明は r 一 L —グルタミル— L —システィンエステル誘導体またはその同一 2分子間の脱水素反応で得られる酸化型 2量体を有効成分とする虚血 · 再灌流組織障害予防及び治療剤、不整脈予防及び治療剤並びに活性酸素 · フリーラジカル障害による各種肺疾患の予防及び治療剤に関する。背景技術
[0003] ダルタチオンは生体内組織に広く存在し、細胞内の主な還元剤であり、触媒 · 代謝 · 輪送そして細胞保護に重要な役割を演じている。特に細胞保護において、グルタチオンは、 ( 1 ) 自分子中の S H基を介して生体内で発生した傷害性に富むフリーラジカルや過酸化物を非酵素的に捕捉 · 無毒化したり、（ 2 ) グルタチオンバーオキシダーゼにより過酸化物のような活性酸素を還元して不活性化させたり、（ 3 ) ダルタチオン一 S — トランスフェラーゼにより毒物と反応し、グルタチオン抱合体として細胞外に排出することにより作用を発揮し、抗酸化、解毒をはじめとして、放射線障害保護、温度耐性を高める等の役割を担っている。
[0004] したがって、組織グルタチォンが各種疾患や老化等により
[0005] 新たな用紙低下すると、組織は傷害を受けやすくなる。そのような場合組織ダルタチオンを正常値まで回復させることは、細胞機能の回復に重要であり、また正常の場合でも、組織グルタチォンを増加させればさらに細胞保護機能を高めることができると考えられている。実際、ダルタチオンやいくつかのチォール化合物を変異原性物質や癌原性物質に対する防御、さらにそれらによって生じた動物肝腫瘍の縮小を目的として使用し、有効だったとの報告もある。
[0006] さらに近年グルタチォン低下と活性酸素種過生成の相閬が、心 · S を始めとした各種組織の虚血 · 梗塞障害、並びに各種肺障害と閬連して注目されるようになった。
[0007] また虚血を血流の再開によって解除すると活性酸素種の生成が加速されてグルタチォンが一層顕著に低下し、より重篤な障害が惹起されることも明らかになりつつある。同じような障害は心、肝、腎、肺、脬、血管などの各種臓器移植時に血流を停止あるいは再開した時にもみられ、また臓器の切開手術や切除時にも問題となる。疾患の原因とされる活性酸素種及び反応性フリーラジカルは、組織を構成する細胞の細胞質及び細胞小器官、特に細胞の活力のもととなる A T Pを産生するミトコンドリアのいずれにも検出される力、ミトコンドリアでは虚血 · 再灌流時に呼吸鎖が発生源となり、その濃度が著しく高くなることが観察されている。また病巣部に集結した白血球の膜表面で生成する細胞外の活性酸素種も隣接した細胞に障害的であるともされている。
[0008] 虚血 · 再灌流時に発生する活性酸素種の消去にグルタチォンが重要な働きをすることは、まず動物を使った疾患モデルでの研究で報告され（例えば、 J. Neurochem.， 3 4卷、 4 7 7 — 4 8 6頁、 1 9 8 0年； Curr. Surgery, 1 一 2月号、 3 1 一 3 3頁、 1 9 8 8年）、さらに人の疾患でも認識された (Circulation, 8 1巻、 2 0 1 — 2 1 1 頁、 1 9 9 0年）。いずれの場合にも病態の重篤度はグルタチオンの消費度に相関するとされている。
[0009] また、各種肺疾患においても、病態の重篤度が肺上皮細胞表面等のグルタチオン低下と相関することが報告されている (例えば、 Lung, 1 6 9巻、 1 2 3〜 1 3 8頁、 1 9 9 1年）従って、このような疾患の予防 · 治療に外部からダルタチオンを補給する意義は推察できるものの、ダルタチオンそのものを投与しても、血中半減期が数分と短く組織グルタチォン上昇にあまり有効でない。その理由は、グルタチオン自体は効率よく細胞に取込まれず、一旦分解されてべプチドゃ構成アミノ酸の形で細胞に取込まれて、再合成される必要があるためと考えられる。
[0010] 以上の問題点を克服し、組織グルタチォン上昇能においてグルタチオンより優れた化合物として、 2 —ォキソチアゾリジン一 4 —カルボキシレート、 Γ — L—グノレタミル一 L— システィン、 r 一 L一グルタミル一 L一システィニル一グリシンェチルエステル（グルタチオンモノェチルエステル）等が、ヒトリンパ腫細胞や動物を用いた実験により知られるようになってきた（例えば、 Curr. Top. Cell. Regul., 2 6卷、 3 8 3 — 3 9 4頁、 1 9 8 5年； Fed. Proc. , 4 3巻、 3 0 3 1 一 3 0 4 2頁、 1 9 8 4年）
[0011] 次の一般式（ I ) ：
[0012] SH
[0013] C00H CH_Z
[0014] H-C-CH₂-CH₂-C-NH-C-C-0-R l I ]
[0015] L 2 I Π
[0016] で表される化合物において、 Rがェチルのものは、特公昭 63 -61302号の記載によって公知であり、 Rが C₃ 〜C ,。の直鎮状、分枝状もしくは環状炭化水素基、または芳香族が置換した C _t 〜C_S の直鎖もしくは分枝状炭化水素基のものは、特開昭 64- 19059号及び特開平 2 — 258727号に記載されており、また Rがメチルのものは、 Flohe らの Z. Klin. Chem. u. Kl in. Biochem. , 8巻、 1 4 9 — 1 5 5頁（ 1 9 7 0 ) の記載によって公知であり特開昭 64 -26516号にも記載されている。
[0017] Flohe らの文献は、 Rがメチルである一般式 [ I ] で示される τ — L—グルタミル— L—システィン誘導体が、グルタチオンバーオキシダ一ゼの基質となり、ダルタチオンに比べて 2 0〜3 0 %の効率で利用されることを示したものである力他の有用性を示唆する記述は一切含まれていない。これに対し、先に挙げた当該公報または 3つの公開特許には、前記一般式 [ I ] で示される r — L—グルタミル一 L—システィンエステル誘導体またはその酸化型 2量体が、ダルタチォン生合成中間体のエステル誘導体であり、良好な膜透過性を有し、組織に効率よく取り込まれた後、脱エステル化を受けて速やかにダルタチォンへと生合成されることにより、組織グルタチオンレベルの向上作用を有していること、肝疾患治療剤、白内障治療剤及び腎疾患治療剤などとして有用であることなどが記載されている。
[0018] また、実験に供する動物種、組織、投与量などにより取り込まれた過剰の r— L 一グルタミル— L —システィンエステル誘導体が、未変化のまま S H化合物として組織に存在することもあるが、本発明者らは r 一 L—ダルタミル一 L —システィンエステル誘導体がそのままの形でグルタチオンバーオキシダ一ゼ、グルタチオン一 S — トランスフェラーゼ、グルタチオンリダクターゼの良い基質になる一方、グルタチオンと違って r —グルタミルトランスべプチダーゼによる分解をうけにくいという種々の好ましい性質を有することも報告している（生化学、 6 1巻、 9号（第 6 2回、日本生化学会大会抄録号）、 8 0 0頁、演題番号 l a - A b 0 8 , 1 9 8 9 年）。発明の開示
[0019] 本発明者らは、組織ダルタチオン向上作用、生化学的グルタチォン代替作用を有する前記一般式 [ I 〗で表される r 一 L 一グルタミル一 L —システィンエステル誘導体及びその同一 2分子間の脱水素反応で得られる酸化型 2量体に関し、雑犬を使った心臓虚血 · 再灌流モデルにおいてこれら誘導体が ( 1 ) 心筋細胞のミトコンドリアのダルタチオンレベル低下を有意に抑制すること、（ 2 ) 心筋細胞のミトコンドリアの機能低下を有意に抑制すること、（ 3 ) 再灌流時の不整脈発生を有意に抑制し、死亡率を有意に減少させることなどを見い出すと共に、ラットを使った肝臓虚血 ·再灌流モデルにおいてもこれら誘導体が；（ 1 ) ミトコンドリア機能の虚血時の低下を抑制すると共に再灌流時の回復を促進すること、
[0020] ( 2 ) 肝組織のグルタチオンレベル低下を有意に抑制すること、（ 3 ) 虚血時に低下した肝組織の A T Pを再灌流時により速やかに面復させること、（ 4 ) 再灌流後の肝組織の過酸化脂質レベル上昇を有意に抑制すること、（ 5 ) 肝組織からの漏出による再灌流開始直後の肝静脈中のアデニンヌクレオチド濃度の上昇及び再灌流後の血中の肝細胞酵素活性の上昇を有意に抑制することを見い出した。本発明者らはさらに、モルモットを使ったオボアルブミン吸入による喘息モデルにおいてもこれら誘導体が；（ 1 ) 気道反応性の亢進（log (Ach PC₂₀。〕の低下）を防止すること、（ 2 ) 肺膜の ^—レセプター数の滅少及びアデ二レートシクラーゼ活性の低下を防止すること、（ 3 ) 肺組織及び気管支肺胞洗浄液のキサンチンォキシダーゼ活性の上昇を抑制することなどを見出した。
[0021] 従って本発明は前記知見に基づき、次の一般式〔 I 〕：
[0022] S H
[0023] C 00 H C H 2
[0024] H - C - C H ₂— C H z - C - NH- C- C - 0 -R
[0025] ί II ί I!
[0026] N H ₂ 0 H O
[0027] (式中、 Rは d 〜 C ,。の直鎮状、分枝状もしくは環状炭化水素基、または芳香族基が置換した C, 〜C₅ の直鎖もしくは分枝状炭化水素基を表わす）
[0028] 新たな ^ ^: で示される r 一 L—グルタミノレー L—システィンエステル導体またはその同一 2分子間の脱水素反応で得られる酸化型 2量体を有効成分とする、心臓、肝臓を始めとした各種組織の虚血 · 再灌流時の組織障害、より具体的には血流の低下、停止、あるいは再開に起因した疾患及び組織障害、例えば狭心症や心筋梗塞 · 脳梗塞のような各種虚血性疾患、各種臓器切開 · 切除 · 移植の術後障害、冠動脈バイパス術、経皮経管的冠動脈形成術、血栓溶解剤適応時の障害、不整脈の予防及び治療、並びに活性酸素 · フリーラジカル障害による喘息を始めとした各種肺疾患の予防及び治療への応用に関する。図面の簡単な説明
[0029] 図 1 A ( a ) 及び図 1 B ( b ) は、犬心臓虚血 · 再灌流モデルにおける心筋ミトコンドリア機能低下、すなわち S ta te IEにおける酸素消費速度（S t . ΙΠ 0 ₂ ) 低下及び呼吸調節比 ( R C I ) 低下に対する r 一 G C Eの予防 · 治療効果をそれぞれ示すグラフである。
[0030] 図 2 A ( a ) 及び図 2 B ( b ) は、ラット肝臓虚血 · 再灌流モデルにおける肝臓ミトコンドリア機能の虚血時の低下及び再灌流時の回復に対する r 一 G C Eの予防 · 治療効果をそれぞれ示すグラフである。
[0031] 図 3 は、モルモット · オボアルブミン吸入モデルにおける気道過敏性（ A c h感受性）の亢進に対する r 一 G C Eの予防 - 治療効果を示すグラフである。
[0032] 図 4 は、モルモット · オボアルブミン吸入モデルにおける肺膜の β一レセプター数の減少に対する r一 G C Eの予防 ' 治療効果を示すグラフである。
[0033] 図 5 は、モルモット ' オボアルブミン吸入モデルにおける肺膜のアデ二レートシクラーゼ活性の低下に対する r— G C Eの予防 · 治療効果を示すグラフである。具体的な説明
[0034] 前記一般式 [ I ] 中、 Rは d 〜 C ,。の直鎮状、分技状もしくは環状炭化水素基、または芳香族基が置換した C , 〜 C : の直鎖もしくは分技状炭化水素基を表わす。また、酸化型 2 量体とは前記一般式 [ I ] の化合物同一 2分子が脱水素反応でジスルフィド結合（一 S— S—）を形成し 2量体となったものである。
[0035] 前記一般式 [ I ] で示される r一 L—ダルタミル— L—システィンエステル誘導体またはその酸化型 2量体は、例えば、特公昭 63- 61302号、特開昭 64- 19059号、特開昭 64- 26516号に記載の方法によって製造することができる。
[0036] 前記一般式 [ I ] において、 Rは具体的には、メチル基、ェチル基、 n ^キシル基、 n—ォクチル基、イソプロビル基、 2 —メチノレ一 2 —プロぺニル基、シクロへキシル基、ベンジル基などが挙げられる。前記一般式 [ I ] で示される化合物は、これら Rの具体的な基が結合した全ての？·一 L—グルタミル— L—システィンエステル誘導体を包含するが、その代表的化合物としては、 r— L—グルタミル一 L—システィンェチルエステルなどが挙げられる„ 前記一般式 [ I ] の Γ 一ダルタミルシスティンエステル誘導体またはその酸化型 2量体を本発明にかかる医薬として用いる場合、これらの化合物は遊離型としてまたは薬学的に許容される酸あるいは塩基の付加塩として使用する。塩として使用する際に付加する酸及び塩基は無機化合物、有機化合物いずれでも良く、塩にした時にも十分な効果を発揮し、生体に無毒性あるいは低毒性のものであればなんら限定されるものではない。
[0037] 前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2量体は、本発明にかかる医薬として予防及び治療のために薬学的に許容される担体、賦形剤、溶剤、希釈剤、着色剤、保存剤、中和剤、安定化剤と混合して所望の剤型として経口的、非経口的または経気道的に投与することができる。
[0038] 経口投与剤は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤、乳化剤、懸濁剤などの液状製剤とすることができる。また非経口投与剤は、注射剤、座剤、皮 Jf外用剤などとすることができる。これらの製剤は前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2量体に薬学的に許容される製造補助剤を加え常法によってつくられる。さらに公知の方法により持続性製剤にすることもできる。
[0039] 経口投与のための固形製剤は、前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2量体と乳糖、デンプン、結晶セルロース、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、ァラビアゴム、リン酸水素カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシゥム、乳酸カルシゥム、塩化ナトリウム、炭酸カルシゥム、力オリンなどの陚形剤とを混合して散剤にするか、必要に応じてヒドロキシプロビルセルロース、ポリビ二ルビ口リドン、白糖、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリゥムなどの崩壌剤を加えて造粒し顆粒剤とする。錠剤はこれらの散剤、顆粒剤をそのまま、あるいは滑沢剤としてタルク、ステアリン酸マグネシウムなどを加えて打錠してつくる。さらに上述の顆粒剤または錠剤をメタァクリル酸メチルコボリマー、ヒドロキシプロビルメチルセゾレロースフタレートなどの基剤で被覆して腸溶性製剤、あるいはェチルセルロース、硬化油などで被覆して持続性製剤にすることも可能である。カプセル剤は散剤または顆粒剤を硬カプセルに充塡するか、前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2量体をグリセリン、ポリエチレングリコール、ォリーブ油などに懸濁あるいは溶解した後ゼラチン膜で覆い、軟カプセル剤とすることもできる。
[0040] 経口投与のための液状製荊は、前記一般式 [ I 〗の化合物またはその酸化型 2量体と白糖、グリセリン、ソルビトールなどの甘味剤とを水に溶かしシロッブ剤にするか、さらにェタノール、精油などを加えてエリキシル剤とするか、またはボリソルベート 8 0、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴムなどを添加し乳化剤あるいは懸濁剤とする。注射剤は、前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2 量体にリン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩酸、乳酸、乳酸ナトリウムなどの P H 調整剤、ブドウ糖、塩化ナトリゥムなどの等張化剤、亜硫酸水素ナトリウム、ァスコルビン酸、エチレンジァミン四酢酸ナトリウムなどの S H基安定化剤とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルまたはボリエチレン製、ガラス製の容器などに充塡し、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内への単回用または長 ♦ 短時間の持続注入用剤とする。また用時調製型の注射剤はさらにデキストリン、シクロデキストリン、マンニトール、ゼラチンなどを加えた後真空凍結乾燥してつくることができる。また公知の方法に従って前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2量体をリボソームやマイクロスフユア一に封入した注射剤にしても良い。
[0041] 座剤は、前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2量体をポリエチレングリコール、ラノリン、脂肪酸のモノ、ジあるいはトリグリセリド、カカオ脂と共に加温 ' 溶融し、冷却可塑するか、大豆油、ボリエチレングリコールなどに懸濁あるいは溶解した後ゼラチンなどで膜被覆してつくることができる。
[0042] 皮 Jf外用剤は前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2量体をポリエチレングリコール、白色ワセリン、流動パラフィンなどに加えて作ることができ、軟膏、クリーム、ゲルなどのいずれの形状のものであっても良い。
[0043] 経気道投与剤は、前記一般式 [ I ] の化合物またはその酸化型 2量体を通常吸入法で微粒子として投与する。薬剤を有効成分として舍有する微粒子は、エアロゾル、粉体などの形体で粒径が 0 . 5 〜 5 0 〃 mのものが好ましい。エアロゾルを発生させる装置としては、例えば超音波式ゃジェット式のネブライザ一、低級アル力ンあるいはフッ素化アル力ンなどを噴射剤に使ったスプレーなどが使える。また粉体は、自発的あるいは強制的呼吸に連動させた簡易型の吸入器などを使つて投与される。
[0044] かかる医薬製剤中の一般式 [ I ] で表わされる化合物またはその酸化型 2量体の濃度に特に限定はないが、一般には製剤中に 0 . 1〜 7 0重量％、好ましくは 1〜 5 0重量％程度が適当である。またその用量にも限定はないが 0 . 0 1〜 5 g /日 Z患者、好ましくは 0 . 1〜2 . 5 g Z日ノ患者程度が適当であり、連続注入を例外として投与回数は通常 1 曰当り 1〜 4面である。実施例
[0045] 次に実施例を示して、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例により限定されるものではない。
[0046] 実施例 1
[0047] 犬心臓虚血 · 再灌流モデルにおける虚血 · 再灌流障害およびそれに伴う不整脈に対する Γ 一 L—ダルタミル一 L一システィンェチルエステル（ r — G C E ) の予防 ' 治療効果実験の方法
[0048] 体重 1 0 kg前後の雌雄の雑種成犬 5 2頭に、ペントバルビタールナトリウム 5 O mgZkgを腹崆内投与して麻酔をかけた後、直ちに気管揷管し Harvard ベンチレーターで人工的換気を続けた。心電図の電極をセッ卜し、実験中、モニター · 記録を続けた。右大腿静脈及び動脈に力ニューレをセットし、それぞれ、水分補給のための生理食塩水の持続点滴や被験薬剤の投与、及び動脈血圧のモニターに用いた。左胸の第四または第五肋間を切開して開胸した後、心膜を破り心臓を露出させた。虚血は左冠状動脈前下行技を第一対角枝の分岐直後で結紮することにより、また再灌流は引続き結紮を解除することにより行った。
[0049] 実験群は 4つに分け、グループ 1 ( n = 9 ) は 2時間虚血群、グループ 2 ( n = 1 7 ) は 2時間虚血 1時間再灌流群、グループ 3 ( n = 1 0 ) は 2時間虚血 1時間再灌流 + r一 G C E 1 0 nigZkg再灌流直前静注群、グループ 4 ( n = 1 6 ) は 2時間虚血ノ 1時間再灌流十還元型グルタチオン（ G S H、対照薬） 1 0 mgZkg再灌流直前静注群とした。
[0050] 虚血 · 再灌流障害の評価は、虚血 · 再灌流終了後、心臓の虚血 · 再灌流部位及び正常部位の（ 1 ) ミトコンドリアのグルタチォン舍量、及び（ 2 ) ミトコンドリァの機能などを測定して行った。ミトコンドリアの調製は、虚血 ♦ 再灌流後直ちに心臓を摘出し氷冷生理食塩水で洗った後、素早く虚血 - 再灌流領域と正常領域を切り出し、それぞれから直ちに、 Ha tef iらの Arch. Biochem. Biophys. , 9 4巻、 1 4 8 — 1 5 5 頁、 1 9 6 1年に記載された方法に従って行った。
[0051] ミトコンドリアのグルタチオン舍量は、調製したミトコンドリァ懸濁液に直ちに 1ノ 1 0体積のスルホサリチル酸二水和物 2 7. 5 % ( wZv ) 水溶液を加えてタンパク変性させた後、遠心して得られた上清について、 Tietzeの Anal. Bioc hem., 2 7卷、 5 0 2 — 5 2 2頁、 1 9 6 9年に記載された方法で測定した。ミトコンドリァ機能の評価は、杉山らの Am. Heart J., 1 0 0卷、 8 2 9 — 8 3 7頁、 1 9 8 0年に記載された方法に従って、呼吸能を酸素電極を用いてボーラログラフ的に測定し、 State Π [における酸素消費速度（St. I 0₂ と呼吸調節比（ R C I ) を求めて行った。
[0052] 不整脈の評価は、心電図を解折し、不整脈すなわち心室性期外収縮の回数、及び心室性期外収縮が 3回以上連続する心室頻拍の積算時間を求めて行った。
[0053] 1. 死亡率
[0054] 表 1に、 2時間虚血時及び引続く 1時間再灌流時の死亡率を示した。 r — G C Eを再灌流直前に投与したグループ 3では再灌流時の死亡率が 0であるのに対し、薬剤無投与のダループ 2あるいは G S H投与のグループ 4では再灌流時に心室細動により約 5 0 %が死亡した。以上の結果は、 r — G C E が再灌流障害による突然死に対し優れた予防 · 治療効果を有することを示している。
[0055] 以下の 2及び 3に記した虚血 · 再灌流障害及び不整脈の解折は、生き残った各群 8頭、計 3 2頭について行った。データは平均値土標準偏差で表わし、有意差検定は DunneU's te stによって行った。 Pが 0. 0 5以下の場合を統計的に有意と見なした。 2. 虚血 · 再灌流障害の予防及び治療効果
[0056] 表 2 に、正常部及び虛血 · 再灌流部心筋ミトコンドリアのグルタチオン舍量を示した。虚血 · 再灌流部の還元型（ G S H ) 及びそれに酸化型（ G S S G) を加えた全ダルタチオン舍量は、グループ 1 に見られるように 2時間虚血後に正常部に比し約 8 0 %に低下し、引続いて 1時間再灌流後にはグループ 2に見られるように約 6 0 %へと一層低下した。これに対し、 r一 G C Eを再灌流直前に 1 0 mgZkg投与したグループ 3では、再灌流後も 8 5〜 8 8 %と高い値であり、再灌流時の一層のグルタチオンの低下を有意に抑制するだけでなく， 2時間虚血の間に起こつたグルタチォン低下をも回復に向かわせる傾向を示した。他方 G S Hを投与したグループ 4では何ら効果が見られなかった。以上の結果は、 G C Eが優れた膜透過性を有し、細胞内器官であるミトコンドリアの虚血 ' 再灌流時のダルタチオンレベル低下に対して、優れた予防 · 治療効果を有することを示している。
[0057] 図 1 A ( a ) 及び図 1 B ( b ) に、正常部及び虚血 · 再灌流部心筋ミトコンドリアの機能、すなわち St. ΠΙにおける酸素消費速度（St. m 0₂ ) 及び呼吸調節比（ R C I ) をそれぞれ示した。 r— G C Eを再灌流直前に 1 O mgZkg投与したグループ 3では、再灌流時のミトコンドリア機能の一層の低下が完全に抑制されるばかりでなく、 r— G C E投与前に起こった虚血時の機能低下も有意に改善されていた。これに対し、 G S Hを投与したグループ 4では、何ら保護効果が見られなかった。以上の結果は、 r— G C Eが心虚血 · 再灌流障
[0058] 新たな紙害の予防 ·治療に優れた効果を有することを示している。
[0059] 3. 不整脈の予防，治療効果
[0060] 表 3に、虚血 · 再灌流時の不整脈（すなわち心室性期外収縮）の回数並びにそれが 3回以上連続する心室頻拍の積算時間を示した。心室性期外収縮は、薬剤無投与のグループ 2に見られるように虚血の 1 2 0分間よりも再灌流 6 0分の間に集中していた。この再灌流時の著明な不整脈の発生は、 r 一 G C Eを再灌流直前に 1 O agZkg投与したグループ 3では顕著に抑制されたが、 G S Hを投与したグループ 4ではまつたく抑制されなかった。心室頻拍の積算時間についても、心室性期外収縮と同様に、 7" — G C Eは再灌流時の増加を顕著に抑制したが、 G S Hは全く効果を示さなかった。以上の結果は、 r 一 G C Eが心虚血 · 再灌流障害に伴う不整脈の発生に対して、優れた予防 ·治療効果を有することを示している。
[0061] 犬心臓虚血 · 再灌流実験中の死亡率
[0062] (死亡頭数ノ実験した頭数）
[0063] 2時間虚血時 1時間再灌流時グル- -プ 1 1 / 9
[0064] グル- -ブ 2 1 / 1 7 8 / 1 6 グル- -プ 3 2 / 1 0 0 / 8 グル- -プ 4 1 / 1 6 7 / 1 5 グルプ 1 2時間虚血
[0065] グルプ 2 2時間虚血/ 1時間再灌流
[0066] グノレプ 3 2時間虚血ノ 1時間再灌流+ r — G C Ε
[0067] 再灌流直前投与
[0068] グルーフ · 4 2時間虚血/ 1時間再灌流 + G S H再灌流直前投与
[0069] Ά1_
[0070] 犬心臓虛血 · 再灌流後の心筋ミトコンドリアの々'ル々チオン含量 ( nmol/ mg protein ) 正常部虚血または再灌流部
[0071]
[0072] 値は平均土標準偏差
[0073] *Ρ<0.05 ； **Ρ <0.01 対応する正常部に対して
[0074] + Ρ<0.05 ； † す Ρ <0.01 グループ 1の虚血部に対して § Ρ ぐ 0.01 グループ 2の再灌流部に対して
[0075] 実施例 2
[0076] ラット肝臓虚血 · 再灌流モデルにおける虚血 · 再灌流障害に対する r - G C Eの予防，治療効果
[0077] 実験の方法
[0078] 体重 2 5 0〜 3 0 0 gの雄性 Wis tar系ラットを、実験前 2 4時間自由に摂水できる状態で絶食させた。 7 2匹のラ 'ントを、 2 4匹ずつ次の 3群、すなわち対照群、 G S H投与群それに r — G C E投与群に分けた。各ラットにペントバルビタ —ルナトリウム 4 0 mg/ 0. 8 ml /kgを腹腔内投与して麻酔をかけ、大腿静脈に力ニューレをセットした。 G S H投与群及び r — G C E投与群には、 G S Hあるいは r — G C Eをそれぞれ 5 O mgZkg静注した。続いて各グループで生理食塩水の 0. 8 ml Zhrの速度での持続静注を注入ポンプを使って開始し、実験の間中続け、容積置換に充てた。生理食塩水注入開始 3 0分後に、正中線に沿って開腹し、肝門を露出させた < Hasselgrenらの J, Surg. Res, , 3 4巻、 4 0 9 — 4 1 4頁、 1 9 8 4年に記載された方法に従って、肝臓左葉と中葉へ移行するすべての脈管、すなわち、肝動脈、門脈、それに胆管をクランプで止め、 2時間閉塞し虚血状態にした。この方法では肝臓の上記以外の部分への血管は閉塞させないため、肝門部の血行停止を回避でき、血液循環の安定化に繋がった。続いて、脈管のすべての閉塞をクランプをはずして解除し、 1時間苒灌流した。腹壁は、虛血および再灌流の間、縫合して閉じておいた。
[0079] 各群 1 8匹を用い、虚血前、 2時間虚血後、 1時間再灌流
[0080] 新たな紙後の各時点で各 6匹ずつから肝臓を摘出した。肝臓の一部は液体窒素中で急速に凍結しグルタチオン、アデニンヌクレオチド及び過酸化脂質の測定に供した。.残りの肝膝から、直ちにミトコンドリアの抽出を Hogeboomと Schneider の J. Biol. Chera., 1 7 2卷、 6 1 9頁一、 1 9 4 8年に記載された方法に従って行った。別途各群 6匹ずつを用いて実験を行い、再灌流開始直後の肝静胨血を採取し、漏出したアデニンヌクレォチドの測定に供した。また、前述の 1時間再灌流後には採血も行い、漏出した肝細胞酵素活性の測定に供した。
[0081] 虚血 *再灌流障害の評価は、肝組織の（ 1 ) ミトコンドリァ機能、（ 2 ) グルタチオン濃度、（ 3 ) アデニンヌクレオチド濃度、（ 4 ) 過酸化脂質濃度、および（ 5 ) 肝組織から漏出した、再灌流開始直後の肝静脈中のアデニンヌクレオチド濃度、（ 6 ) 1時間再灌流後の血中の肝細胞酵素活性を測定して行った。すなわち、（ 1 ) のミトコンドリァ機能は、 Chanceらの Adv. Enzymol , 1 7卷、 6 5頁—、 1 9 5 6年に記載された方法に従って測定した。また、（ 2 ) のダルタチォン定量は、肝組織に対しその重量の 1 0倍体積のスルホサリチル酸二水和物 2. 5 % ( w/v ) 水溶液を加えてホモジヱナイズした後遠心して得られた上清について、実施例 1 と同様の方法で行った。また、（ 3 ) のアデニンヌクレオチド定量は、 Suginoらの J. Chromatogr. , 3 6 1巻、 4 2 7 — 4 3 1頁、 1 9 8 6年に記載された方法に従って、肝組織の過塩素酸抽出液を水酸化力リゥムで中和後沈毅を除いてから、イオン交換 H P L Cにかけて行った。また、（ 4 ) の過酸化
[0082] 新たな紙脂質の測定は、 Ohkawaらの Anal. Biochem. , 9 5卷、 3 5 1 頁—， 1 9 7 9年に記載されたチォバルビツール酸法に従つて行った。また、（ 5 ) のアデニンヌクレオチド定量は、肝静脈血を遠心して血清を取り、さらに血清中のタンバクをマイク口フィルターを使った遠心で除いた後、（ 2 ) と同様に H P L Cにかけて行った。また、（ 6 ) の A S Τ , A L T及び L D Hなどの活性測定は Uni-Kit(Chugai， Co. Ltd, Tokyo: Japan) ¾:用いて了った _c
[0083] すべての結果は、平均値土標準偏差で表わした。有意差検定は DunneU's testにより行った。 Pが 0. 0 5以下の場合を統計的に有意と見なした。
[0084] 結果
[0085] 図 2 A ( a ) 及び図 2 B ( b ) に、肝組織ミトコンドリアの機能を示した。 7" — G C Eは虚血によって引き起こされる St. 1Π O z 低下を有意に抑制し、また再灌流時の機能回復を有意に促進した。これに対し、 G S Hは何ら保護効果を示さなかった。
[0086] 表 4に、肝組織のグルタチオン濃度の変化を示した。ダルタチオン濃度は、対照群及び G S H投与群では再灌流後に虛血前の約 6 0 %及び約 7 0 %にそれぞれ有意に低下するのに対し、 r 一 G C E投与群では、実験の間を通して有意な低下は見られなかった。しかも、 r 一 G C E投与群の肝臓グルタチオン濃度は実験の間を通じて、対照群または G S H投与群よりも有意に高かった。
[0087] 表 5に、肝組織アデ二ンヌクレオチド濃度の変化を示した _c
[0088] STたな g紙 2時間虚血は、 AT P , A D Pの顕著な減少及び逆に AM P の増加を引き起こした。 r 一 G C Eは、虚血によって引き起こされる AT P減少に対しては何ら効果を示さなかったが、再灌流後の AT P回復を有意に促進した。 G S Hには、 AT P回復促進効果はなかった。表 3
[0089] 犬心臓虛血 · 再灌流時の不整脈心寮性期外収縮（面）心室頻拍の積笪時閽（秒）
[0090] 2時間 1時間 2時間 1時間虚血時再灌流時虛皿特再灌流時グループ 1 30±31 3±6 ^
[0091] 2 11±15 1376±956 0±1 1029±671 3 40±51 32±30* 1±2 3±5* 4 42±43 1731±1574 1±2 983±959 値は平均土標準偏差
[0092] * Ρ < 0 0 1 ：グループ 2の 1時間再灌流時に対して
[0093] 新たな ^紙 £4
[0094] ラ 'ント JffMfii ·濯流時の
[0095] 腿織グルタチォン離の変化グノレタチオン（#mol/gS¾gS)
[0096] GSH GSSG GSH+GSSG 前
[0097] 対照群 4.92±0.58 0.30±0.05 5.22±0.57
[0098] GSH m 4.91±0.35 0.38±0.06 5.29±0.38 r -GCE 5.65±0.3(Γ 0.39±0.07- 6.04±0.35* 対照群 4.25±0.48 0.26±0.04 4.51±0.48
[0099] GSH投雜 4.35±0.65 0.35±0.04·* 4.40±0·68 r -GCE投雜 5.48±0.42** 0.39±0.0Γ 5.87±0.43^ 1 B|¾靈流後
[0100] 対照群 3.01±0·53^Ββ 0.20±0.05 3.22±0.57^
[0101] GSH投 3.40±0.60^β 0.37±0.05- 3.77±0.64^ss ΐ -GCE投雜 4.97±0.25 0.54±0.09- 5.50±0.26** すべての値は、 6個の分析値の平均土^^として示す。
[0102] *P<0.05 ； **P <0.01 ：対照群に対して
[0103] M く 0.01 ：各群の; Ufll前に対しラット SMlfil醒流時の腿織
[0104] アデ二ンヌクレオチド¾ ¾の変化
[0105] アデニンヌクレオチド（^woi/g!F^fiS)
[0106] ATP ADP AMP ATP+ADP +AMP 戯前
[0107] m 2.71±0. 0.85±0.07 0.19±0.02 3.75±0.18
[0108] GSH投雜 2.57±0·16 0.65±0.06 0.18±0.01 3.40±0·2(Γ Γ— GCE投雜 2·69±0·15 0.57±0*05 0.13±0.01 3.39±0.16* 後
[0109] 対照群 0.05±0.01 0.14±0·02 0.83±0.08 1.02±0.10 GSH投雜 0·04土 0·01 0.13±0.02 0.73±0·11 0·90±0·11 r-G E 0.06±0.01 0.17±0.03 0·87±0.11 1.10±0.10
[0110] 1離爾流後
[0111] 対照群 1·06±0.08 0.27+0.02 0.09±0.01 1·42±0·09 GSH投雜 1.13±0.13 0.15士 0· 02 1·66±0·16 Γ— GCE投機 1.70±0.02*' 0.38±0.03·* 0.12±0.01 2.21±0.03*' すべての値は、 6個の分折値の平均土^^として示す。
[0112] *Ρ<0.05 ； **Ρ <0.01 ：対照群に対して
[0113] 肝過酸化脂質濃度
[0114] 再灌流の後、肝過酸化脂質濃度（ 9 . 7 ± 0 . ί ηοϊ y Big 蛋白質）は 2時間虚血後のそれ（ 6. 4 ± 0. 6 nmol / mgfe 白質）に比べて有意に（ Ρく 0 . 0 1 ) 増加した。ァ一 G C Εの投与はこの増加を有意に抑制した（ 6. 5 6 :t 0. 6 nm olノ mg蛋白質， Pく 0 . 0 1 ) 。しかしながら、 G S Hの投与は何ら保護効果を有しなかった（ 9. 1 ± 2. 0 nmol/mg 蛋白質）。
[0115] アデニンヌクレオチド及び肝細胞酵素の漏出
[0116] Γ一 G C Eは、表 6に示すように再灌流開始直後に観察される肝静脈中へのアデ二ンヌクレオチドの漏出を有意に 5 0 %以上滅少させると共に、表 Ίに示すように 1時間再灌流後の血中に見られる肝細胞からの漏出酵素をも有意に減少させた。 G S Hの投与によってはアデニンヌクレオチドの漏出及び肝細胞酵素の漏出のいずれも有意に軽減させなかった。
[0117] 再灌流開始直後の肝静脈中の
[0118] アデニンヌクレオチド濃度
[0119] アデニンヌクレオチド
[0120] (〃 mol / L血清）対照群 4.23±2.04
[0121] G S H投与群 3.59±1.28
[0122] r一 G C E投与群 1.96±0.80*
[0123] すべての値は、 6個の測定値の平均土標準偏差として示す。
[0124] * ：対照群に対し Pぐ 0. 0 5
[0125] 1時間再灌流後の血清 A S T
[0126] A L T及び L D H濃度
[0127] I U/ L
[0128] AS T A L T L D H
[0129] 対照群 4805±1260 2957土 936 39928± 14416 GSH 投与群 3914±1102 2337土 571 26435±12191 r - GCE 投与群 2071±625 924土 330*' 14678± 2763*' すべての値は、 6個の分折値の平均土標準偏差として示す。酪号 AS T ：ァスバラギン酸ァミノトランスフェラーゼ、
[0130] AL T : ァラニンアミノトランスフェラーゼ、 L D H :乳酸脱水素酵素。
[0131] * * ：対照群に対し P < 0. 0.1
[0132] f 以上の結果は、 r一 G C Eが肝虚血 · 再灌流障害の予防 · 治療に優れた効果を有することを示している。
[0133] 実施例 3
[0134] モルモット ' オボアルブミン吸入モデルにおける気道反応性亢進に対する T 一 G C Eの予防 · 治療効果
[0135] 実験の方法
[0136] 体重 3 5 0〜4 0 0 gの雄性 Hart ley 系モルモットを使い、対照群、オボアルブミン（OA) 群、および、 0 A + r— G C E群の 3つに分けた。対照群には、生理食塩水のヱァロゾルを毎日？〜 8分、 1 0 日間連続して吸入させた。 O A群には、 2 %OAのエアロゾルを同様に吸入させた。 OA十 r— G C E群には、 2 %OAのエアロゾルを同様に吸入させる他.. Γ — G C Eを 1 0 mg/kg、 1 日 2画、 1 0 日間、腹腔内投与した。
[0137] 薬効の判定は、（ 1 ) 気道反応性の指標として気道抵抗性がベースラインの 2 0 0 %以上を示すのに最低必要なァセチノレコリン濃度 ( Ach _Provocative Concentration 200 ) を 1 0 日間吸入の前後で測定すると共に、 1 0 日間吸入後の、 ( 2 ) 肺膜の / 一レセブター数及びアデ二レートシクラ一ゼ活性、並びに（ 3 ) 肺組織、気管支肺胞洗浄液、及び血清のキサンチンォキシダーゼ活性、を測定して行った。
[0138] 各測定には、各群 6匹ずつを用い、結果は平均値土標準偏差で表わした。有意差検定は、 Dunnett's testで行った。 P が 0. 0 5以下の場合を統計的に有意と見なした。
[0139] 結果
[0140] 図 3に気道反応性の指標として log[Ach PC₂。₀]を取り、吸入前後の変化を示した。図 4及び 5に、 1 0 日間吸入後の肺膜 ^一レセブター数、及び肺膜アデユレ一トシクラ一ゼ活性をそれぞれ示した。表 8 に 1 0 日間吸入後の肺組織、気管支肺胞洗浄液及び血清中のキサンチンォキシダーゼ活性を示す。
[0141] 8
[0142] 肺組織、気管支肺胞洗净液及び血清中のキサンチンォキシダーゼ活性 jjtft卞
[0143] 試験群肺組織血清肺胞洗浄液
[0144] (aUZ組織） (Μϋ/Βΐΐ) (BIU/BD 対照群 7.35±6.48 2.85±1.17 3.51±1.15
[0145] OA群 49.1±11.7* 12.6±3.16 11.5±2.66*
[0146] 0A+ r -GCE群 33.3±4.02*" 9.43±0.95*† 10.0±1.77* 值は平均値士標準偏差を示す。
[0147] * ：対照群に対し P < 0. 0 1
[0148] # : O A群に対し P < 0. 0 1
[0149] す： OA群に対し Pく 0. 0 5
[0150] Γ — G C Eを投与すると、 O A吸入による（ 1 ) 気道反応性の顕著な亢進（log[Ach PC₂。。]の顕著な低下）、（ 2 ) 膜ーレセプター数の著明な減少（ 3 8 %滅）、膜アデ二レートシクラーゼ活性の著明な減少（イソプロテレノ一ル剌激時 ··· 3 8 %減、基底時… 2 8 %滅）のいずれも防止され、 OA 吸入を行っているにも拘らず、 0 Aを投与しない時と同じ値が維持されていた。また、キサンチンォキシダーゼの値も、肺組織及び気管支肺胞洗浄液などでは OA + r — G C E群の方が O A群よりも有意に低値を示した。
[0151] O A吸入による気道過敏症（喘息）発症の機構は、 O A吸入に伴い何らかの機構でキサンチンデヒドロゲナーゼがキサンチンォキシダーゼへ変換されるとォキシジェンラジカルが産生され、今度はこれが酵素変換を著明に加速させたりレセ
[0152] 新たな甩紙ブター機能の低下を舍めた組織障害を憎悪させたりするのではないかと考えられている。以上の結果は、 r — G C Eがラジカルス力ヴヱンジャーとしてこの悪循環を断つことにより活性酸素 · フリ一ラジカル障害による喘息を始めとした各種肺疾患の予防 ' 治療に優れた効果を有することを示している,
[0153] 新たな ^紙

权利要求:
Claims 請求の範囲
1. 下記一般式：
SH
C00H CH₂
H-C-CH₂-CH₂-C-NH-C-C-0-R
L I il
(式中、 Rは C ₁ 〜。の直鑌状、分技状もしくは環状炭化水素基、または芳香族が置換した C _t 〜 C ₅ の直鎖もしくは分技状炭化水素基を表わす）
で示される 7· 一 L一グルタミル一 L一システィンエステル誘導体またはその同一 2分子間の脱水素反応で得られる酸化型 2量体を有効成分とする虚血 · 再灌流組織障害の予防又は治療剤。
2. Rが低級アルキル基である請求項 1記載の虚血 · 再灌流組織障害予防又は治療剤。
3. Rがェチル基である請求項 1記載の虚血 · 再灌流組織障害予防又は治療剤。
4. 心臓障害予防 · 治療剤である請求項 1 , 2、または 3 記載の虚血 · 再灌流組裰障害予防又は治療剤。
5. 肝臓障害予防 ·治療剤である請求項 1 , 2、または 3 記載の虚血 · 再灌流組織障害予防又は治療剤。
6. 下記一般式： SH
COOH CH_Z
I I
H-C-CHz-CHz-C-NH-C-C-O-R
i a¹
(式中、 Rは C , 〜 C i。の直鎖状、分枝状もしくは環状炭化水素基、または芳香族が置換した C , 〜 C ₅ の直鎖もしくは分枝状炭化水素基を表わす）
で示される r 一 L —グルタミル一 L—システィンエステル誘導体またはその同一 2分子間の脱水素反応で得られる酸化型 2量体を有効成分とする不整脈の予防又は治療剤。
7. Rが低級アルキル基である請求項 6記載の不整脈の予防又は治療剤。
8. Rがェチル基である請求項 6記載の不整脈の予防又は治療剤。
9. 下記一般式：
SH
I
COOH CH_Z
I I
H-C-CH₂-CH_z-C-NH-C-C-0-R
(式中、 Rは C , 〜 C ,。の直鎖状、分技状もしくは環状炭化水素基、または芳香族基が置換した d 〜 C ₅ の直鎖もしくは分枝状炭化水素基を表わす）
で示される r — L—グルタミル一 L —システィンエステル誘導体またはその同一 2分子間の脱水素反応で得られる酸化型 2量体を有効成分とする活性酸素 · フリーラジカル障害による肺疾患の予防又は治療剤。
10. Rが低級アルキル基である請求項 9 記載の活性酸素 - フリーラジカル障害による肺疾患の予防又は治療剤。
11. Rがェチル基である請求項 9記載の活性酸素 · フリーラジカル障害による肺疾患の予防又は治療剤。
12. 喘息予防又は治療剤である請求項 9 , 1 0、または 1 1記載の活性酸素 · フリーラジカル障害による肺疾患の予防又は治療剤。

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AU655814B2|1995-01-12|

DE69214250D1|1996-11-07|

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AT143593T|1996-10-15|

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法律状态:
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1992-10-29| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU CA JP KR US |

1992-11-23| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 2083609 Country of ref document: CA |

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1996-10-02| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1992908270 Country of ref document: EP |

优先权:

申请号 | 申请日 | 专利标题

JP3/108163||1991-04-15||

JP10816391||1991-04-15||EP92908270A| EP0538476B1|1991-04-15|1992-04-15|Preventive or remedy for ischemia, reperfusion-induced tissue disorder and arrhythmia as well as pulmonary disorder caused by activated oxygen free radical|

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